大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告
學(xué)院:化工學(xué)院 專業(yè)班級(jí):08生物工程1班
課題名稱 米曲霉為宿主菌的基因高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立
1、本課題的的研究目的和意義:
絲狀真菌中的米曲霉生長迅速、易于培養(yǎng)、有著很高的蛋白分泌能力,且又是公認(rèn)的
食品安全生產(chǎn)菌株,發(fā)酵及后處理技術(shù)成熟,是我國重要的微生物資源。故經(jīng)過一定的改良,其可構(gòu)建使目的基因高效表達(dá)的米曲霉代謝工程菌。
CaCl2-PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法是絲狀真菌最常用的轉(zhuǎn)化方法,其中原生質(zhì)體的制備率和再生率會(huì)直接影響進(jìn)一步的基因轉(zhuǎn)化效果。本實(shí)驗(yàn)課題研究和優(yōu)化米曲霉原生質(zhì)體形成以及細(xì)胞壁再生的條件,以提高米曲霉基因轉(zhuǎn)化效率,為進(jìn)一步的基因改造工作奠定基礎(chǔ)。
2、 文獻(xiàn)綜述(國內(nèi)外研究情
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為困難,所以這方面研究的深度和廣度,比菌絲分離原生質(zhì)體有較大的差距[6]。
國內(nèi)米曲霉原生質(zhì)_備研究中主要采取了單因素法和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,在已有的最佳米曲霉原生質(zhì)_備的條件下[7],本課題以探究菌齡[8],酶解溫度、酶解時(shí)間、酶液濃度、酶體系[9][10],菌絲預(yù)處理方式、再生培養(yǎng)方式[11][12]等條件對(duì)米曲霉原生質(zhì)_備的影響。本課題將綜合各種文獻(xiàn)并在實(shí)際實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,探究和完善米曲霉原生質(zhì)_備的方法,為進(jìn)一步的基因改造工作奠定基礎(chǔ)。
3、 本課題的主要研究內(nèi)容(提綱)和成果形式:
本課題以米曲霉分生孢子為對(duì)象制備原生質(zhì)體,對(duì)影響原生質(zhì)_備和再生的條件,包括培養(yǎng)條件、菌齡、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶液濃度,菌絲預(yù)處理、再生培養(yǎng)基等進(jìn)行研究,確定制備米曲霉原生質(zhì)體的最優(yōu)化條件,為構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。 米曲霉制備原生質(zhì)體,有兩種基本方式:一種是利用米曲霉菌絲_備;另一種是利用米曲霉孢子制備。本課題中除了分別對(duì)兩種方法做出制備條件探索外,還會(huì)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),以更加完善米曲霉原生質(zhì)_備的條件優(yōu)化。
本課題致力于米曲霉原生質(zhì)_備研究,主要的成果展示為米曲霉菌株展示,其中包含了一些實(shí)驗(yàn)測的的數(shù)據(jù)以及和國內(nèi)研究情況的對(duì)比分析。最終的成果主要以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)物圖來組合展示,已提供直接的學(xué)習(xí)、研究材料,以備今后做進(jìn)一步的探究。
4、擬解決的關(guān)鍵問題:
1.米曲霉分生孢子制備原生質(zhì)體比菌絲更困難,如何順利完成其原生質(zhì)_備;
2.優(yōu)化原生質(zhì)_備方法,提高制備率和再生率,以最終提高轉(zhuǎn)化效率。
5、研究思路、方法和步驟:
研究思路和步驟:
1、平板法培養(yǎng)米曲霉菌株P(guān)-5;
2、蝸牛酶+纖維素酶混合酶液,對(duì)P-5作用制備原生質(zhì)體,此處進(jìn)行多項(xiàng)單因素探究實(shí)驗(yàn);
3、在探究各種單因素的變化對(duì)米曲霉原生質(zhì)_備的影響時(shí),主要通過顯微鏡原生質(zhì)體觀察計(jì)數(shù)法來計(jì)算原生質(zhì)_備率,表征各因素最佳值;
4、在各種相關(guān)因素探究完成后,進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)法,控制各種因素的最佳值進(jìn)行原生質(zhì)體再生,計(jì)算制備率和再生率。
原生質(zhì)_備率 =(A-C)/A*100%
原生質(zhì)體的再生率=[(B-C)/(A-C)]*100%
備注:A為對(duì)照菌液再生菌落數(shù)
B為制備得原生質(zhì)體在高滲培養(yǎng)基生長菌落數(shù)
C為原生質(zhì)體在普通培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)。
主要的研究方法:
1、本課題中,經(jīng)過對(duì)相關(guān)的文獻(xiàn)閱讀和一定的實(shí)驗(yàn)比較,建立了米曲霉玻璃紙平板培養(yǎng)法的實(shí)際操作體系;
2、本課題中對(duì)原生質(zhì)體的破壁,采用了蝸牛酶+纖維素酶混合酶液酶解法;
3、本課題中需要探究相關(guān)條件對(duì)米曲霉原生質(zhì)_備的影響,故采取了單因素法以及多因素組合法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,以探索優(yōu)化條件;
4、本實(shí)驗(yàn)中,采取了兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示的方法:第 ……(未完,全文共3056字,當(dāng)前僅顯示1543字,請(qǐng)閱讀下面提示信息。
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