論文開題：固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器的研究

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告

課題名稱 固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器的研究

1、 本課題的的研究目的和意義：
木聚糖酶(*ylanase)是降解木聚糖酶系中最關(guān)鍵的酶，在飼料、食品、紡織、造紙等行業(yè)應(yīng)用廣泛，是重要的工業(yè)用酶之一。但該酶穩(wěn)定性差、保質(zhì)期短、重復(fù)利用率低、應(yīng)用成本高，因此木聚糖酶的廣泛應(yīng)用受到了一定的限制[1]。類彈性蛋白(Elastin-like polypeptides，ELPs)具有對(duì)溫度及鹽濃度等敏感相變的性質(zhì)，通過可逆熱循環(huán)(Inverse thermal cycling，ITC)方法純化蛋白可以達(dá)到有高效的，成本低廉的特點(diǎn)。通過基因融合的方法合成木聚糖酶-類彈性蛋白的重組蛋白，利用類彈性蛋白的可逆相變性質(zhì)將重組蛋白純化出來，得到固定化木聚糖酶。將固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器，使定向固定與木聚糖酶的催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，這種方法比較溫和，節(jié)省了純化步驟的開支，同時(shí)更有利于應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。研究固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，可以為酶膜反應(yīng)器以及工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
2、 文獻(xiàn)綜述（國內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：
定向固定主要是通過不同的方法,將酶的特定位點(diǎn)與載體連接, 使酶在載體表面按一定的方向排列, 使它的活性位點(diǎn)面朝固體表面的外
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其中有大部分的重組蛋白沒有回復(fù)可溶的狀態(tài)，只有很少一部分的變?yōu)榭扇軤顟B(tài)，原因可能是重組蛋白在發(fā)生想變時(shí)與雜蛋白一起聚集成顆粒，很多雜蛋白與酶鑲嵌在一起甚至包裹著酶從而使得酶無法回復(fù)能可溶的狀態(tài)，但是ELP連接的重組蛋白可以作為分子定向固定，而且這種定向固定化是通過共價(jià)鍵連接，連接的非常穩(wěn)定。因此研究這種分子標(biāo)簽作為載體的定向固定有很大的意義。
生物反應(yīng)器，是指利用酶或生物體（如微生物、動(dòng)植物）所具有的特殊功能，在體外進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的裝置系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)是研究固定化木聚糖酶催化木聚糖酶水解的反應(yīng)，故使用的反應(yīng)器又可稱為酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器可以分為[12]：分批式反應(yīng)器、連續(xù)流反應(yīng)器以及中空纖維反應(yīng)器等。其中，分批反應(yīng)器為最簡單的酶反應(yīng)器，只需要加入固定化酶，使其懸浮于攪拌罐中，這種反應(yīng)的速度決定于攪拌速度。而本實(shí)驗(yàn)是將固定化木聚糖酶與木聚糖置于適宜條件下的恒溫水浴磁力攪拌器中，讓其可以在適宜的攪拌速度下均勻穩(wěn)定的進(jìn)行酶促反應(yīng)，屬于間歇式酶反應(yīng)器[13]。通過測定反應(yīng)過程中不同時(shí)間內(nèi)的木聚糖水解度，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，從而進(jìn)一步分析該反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)[14]，最終確定該酶促反應(yīng)所具有的最適反應(yīng)條件，例如：底物最適濃度、反應(yīng)器有效體積等。

3、 本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
類彈性蛋白具有對(duì)鹽濃度和溫度敏感的相變性質(zhì)可以用來純化與其相連接的蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)含有類彈性蛋白-木聚糖酶重組蛋白的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過離心得到菌體之后，進(jìn)行細(xì)胞破碎。將木聚糖酶置于高于相變溫度的環(huán)境中，之后再置于相變溫度之下的環(huán)境中，大部分呈現(xiàn)聚集狀態(tài)的固定化酶不能很好的恢復(fù)到松散的狀態(tài)，因而研究相變溫度之上的聚集態(tài)固定化酶的性質(zhì)。利用ITC可逆相變循環(huán)的方法純化出一小部分重組蛋白，大部分的酶定向固定在ELP標(biāo)簽上，將固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器中，使其與木聚糖進(jìn)行酶促水解反應(yīng)，通過設(shè)定反應(yīng)器中的適于酶促反應(yīng)的條件，使酶促反應(yīng)可以在溫和持續(xù)不變的反應(yīng)條件下反應(yīng)完全，通過實(shí)驗(yàn)考察得到固定化木聚糖酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，重復(fù)利用次數(shù)、最適反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)器的有效體積等，并優(yōu)化生物反應(yīng)器中酶促反應(yīng)的最佳條件。
4、擬解決的關(guān)鍵問題：
（1）、提高固定化木聚糖酶的回收率。
（2）、固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器時(shí)最佳反應(yīng)條件的確定。
5、研究思路、方法和步驟：
（1）、將含有類彈性蛋白-木聚糖酶的重組蛋白的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)；
（2）、將收集到的大腸桿菌進(jìn)行超聲波破碎；
（3）、對(duì)破碎的菌體進(jìn)行ITC可逆相變循環(huán)，收集固定化木聚糖酶；
（4）、固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器中的反應(yīng)條件的優(yōu)化；
（5）、測定固定化酶可以重復(fù)利用的次數(shù)；
（6）、測定并分析固定化酶用于生物反應(yīng)器中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
6、本課題的進(jìn)度安排：
2013年3月1日至2013年3月20日，有關(guān)文獻(xiàn)的查找。
2013年3月21日至2013年4月5日，固定化木聚糖酶的提取、純化以及酶活的測定。
2013年4月10日至2013年5月， 構(gòu)建固定化木聚糖酶反應(yīng)器，測定相關(guān)參數(shù):固定化木聚糖酶重復(fù)利用次數(shù)、反應(yīng)初速度、反應(yīng)常數(shù)等。
2013年5月至6月， 寫論文，準(zhǔn)備畢業(yè)答辯。
7、參考文獻(xiàn)：
1. 張麗萍, 陳晨, 殷婷婷, 等. 固定化木聚糖酶的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)世界, 2010, 636(1)(11):697-700.
2. Wilchek M, Miron T. Oriented versus random protein immobilization. J Biochem Biophys Methods 2003,55:67-70.
3. Gaj T, Meyer SC, Ghosh I. The AviD-tag, a NeutrAvidin/avidin specific peptide affinity tag for the immobilization and purification of recombinant proteins. Protein e*pression and purification 2007,56:54-61.
4. Kuan I, Liao R, Hsieh H, Chen K, Yu C. Properties of Rhodotorula gracilis d-Amino Acid O*idase Immobilized on Magnetic Beads through His-Tag. Journal of bioscience and bi ……（未完，全文共4966字，當(dāng)前僅顯示2508字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《論文開題：固定化木聚糖酶用于生物反應(yīng)器的研究》）