醫(yī)學(xué)論文：MicroRNA-21抑制劑聯(lián)合伊馬替尼對慢性粒系白血病K562細胞增殖的作用

醫(yī)學(xué)論文：MicroRNA-21抑制劑聯(lián)合伊馬替尼對慢性粒系白血病K562細胞增殖的作用
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趙廣富1，朱貴華1，蘇林2
（1.連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇連云港 222023；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005）
摘要：
目的 探討microRNA-21基因拮抗聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼對慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞的增殖及周期的調(diào)控作用。
方法 在293TN細胞中包裝并收獲可以抑制內(nèi)源microRNA-21表達的重組慢病毒顆粒，進行病毒滴度測定后，感染K562，經(jīng)流式分選得到GFP陽性的K562細胞株。Northern blot證實感染后microRNA-21的表達，MTT法檢測細胞存活率，流式細胞儀檢測細胞周期。
結(jié)果 Northern blot證實K562細胞中microRNA-21的表達水平與正常人外周血細胞相比明顯升高。抑制microRNA-21表達的K562細胞株生長速度明顯減慢，細胞周期運行也受到阻滯；伊馬替尼作用于microRNA-21表達抑制的K562細胞后，細胞增殖與伊馬替尼單獨作用的
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cle was measured by flow cytometry.
Results MicorRNA-21 was significantly up-regulated in K562 cells compared with peripheral blood cells from normal. Inhibition of micorRNA-21 in K562 cells decreased cell proliferation and cell cycle progression. The growth of K562 cells tranduced with Lenti-miR-21 was markedly inhibited after imatinib treatment. Moreover, The percentage of cells at G0/G1 phase greatly increased after transduction with Lenti-miR-21 to K562 combined with imatini.
Conclusion The inhibition of micorRNA-21 in combination with imatinib has a synergistic effect on the proliferation and cell cycle progression of K562 cells.
Key words:microRNA-21;imatinib;k562 ;
micorRNA（小RNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)分子，它通常通過與靶mRNA分子互補結(jié)合使mRNA的翻譯受阻或使靶mRNA降解而抑制其表達[1]。microRNA所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控已經(jīng)成為公認(rèn)的真核生物基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成結(jié)構(gòu)，并與轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳調(diào)控因子等協(xié)同作用共同完成復(fù)雜生命活動的調(diào)節(jié)。已有的研究結(jié)果證明microRNA的作用深入到了生命活動的各個方面，包括組織器官發(fā)育、細胞增殖和凋亡、能量代謝、細胞遷移和病毒感染等等[2,3]。而且越來越多的證據(jù)表明許多microRNA參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，相應(yīng)地，在體外和動物體內(nèi)也有實驗證實通過外源干預(yù)microRNA的表達可以達到抑制腫瘤細胞生長的目的[2-4]。
最近，有報道指出microRNA-21在慢性髓系白血�。–ML）患者中表達顯著上升，使用體外合成的microRNA-21抑制劑轉(zhuǎn)染人慢性髓系白血病細胞系K562，能夠抑制細胞的增殖和遷移，說明拮抗microRNA-21在CML治療中的潛在價值[5]。伊馬替尼是傳統(tǒng)的CML治療藥物，但也存在耐藥復(fù)發(fā)的問題，因此，尋找新的CML治療靶點，并實驗聯(lián)合用藥對于極大程度上緩解CML具有重要意義。本研究在了解microRNA-21參與CML發(fā)生發(fā)展的分子機制基礎(chǔ)上，實驗microRNA-21抑制劑聯(lián)合伊馬替尼對髓系白血病細胞系K562增殖和凋亡的影響，為microRNA應(yīng)用于白血病的臨床治療，以及將microRNA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用提供依據(jù)。

1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1主要藥物及試劑
伊馬替尼(瑞典Novartis公司贈送)，用三蒸水配制成1mmol／L溶液，過濾除菌。CML急變期細胞株K562由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心保存。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），無支原體胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），RNA提取試劑盒Trizol（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），PCR試劑盒（北京博邁德公司），pcMIRNA慢病毒表達質(zhì)粒（美國SBI公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）。
1.1.2主要儀器
PTC100型PCR儀由美國MJ Research股份有限公司制造，DYCZ-26B電泳儀由北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司制造，F(xiàn)ACSAria流式細胞儀由美國BD公司制造。

1.2 方法
1.2.1細胞培養(yǎng)及外周血單個核細胞的獲得
人慢性髓系白血病細胞系K562由本室保存，將細胞置于含10％胎牛血清、1*105IU／L青霉素及1*105IU／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
將所采集的新鮮正常人外周血以含2mmol/L EDTA的1*PBS按照1:4體積進行稀釋，然后用滴管反復(fù)吹打混勻。在20*150mm滅菌試管底部加入4ml 淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml)。將稀釋好的外周血用滴管輕輕鋪于分離液上，20°C，400g水平離心30~40min。小心地吸取中間相(含單個核細胞)到一個新的50ml離心管中。管中再加入含2 mM EDTA的1*PBS， ……（未完，全文共9652字，當(dāng)前僅顯示2636字，請閱讀下面提示信息。收藏《醫(yī)學(xué)論文：MicroRNA-21抑制劑聯(lián)合伊馬替尼對慢性粒系白血病K562細胞增殖的作用》）