兔巴氏桿菌-波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、效力試驗

　　兔巴氏桿菌-波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的
　　研制及安全、效力試驗
　　兔多殺性巴氏桿菌病(pm)和兔支氣管敗血波氏桿菌病(bb)是家兔的兩種主要細菌性傳染病,它們傳播迅速,一旦在兔場暴發(fā)流行,很難根除,經(jīng)濟損失慘重。進行疫苗接種是預防這兩種疾病的最有效的措施。免疫原性好的菌(毒)種和良好的免疫佐劑是保證疫苗免疫效力的必要條件。因此,在pm和bb基礎菌種研究的基礎上,對蜂膠的提取工藝進行了研究,選取了蜂膠乙醇提取液的水溶物作為佐劑,研制疫苗,并進行了疫苗的安全及效力試驗�，F(xiàn)將該研究結果報告如下。
　　1材料與方法
　　1.1儀器及材料
　　1.1.1菌種兔多殺性巴氏桿菌pm90株(對家兔的致死劑量為8-10個活菌,對小鼠的致死劑量為100個活菌);兔支氣管敗血波氏桿菌bb82株(對小鼠的致死劑量為1*107個活菌,對家兔的致病劑量為1*108個活菌)。
　　1.1.2試驗動物不同日齡的健康大耳白兔
　　1.
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除去甲醛,無菌刮下菌苔,用等量的滅菌生理鹽水配成原濃度的菌液。小量分裝后反復凍融3次,再次進行無菌檢驗。
　　1.2.2bb82菌液的制備與檢驗將bb82株第7代凍干菌種接種于bms培養(yǎng)基上,37℃條件下培養(yǎng)24h,然后選5-10個典型菌落,分別接種于10%綿羊鮮血瓊脂斜面若干,同上培養(yǎng)后,作為一級種子。置4℃保存,可使用7日。繼代不超過3代。二級種子的繁殖以及制苗用菌液的培養(yǎng)、滅活、離心及凍融參照1.2.1
　　1.2.3蜂膠佐劑的制備經(jīng)過工藝優(yōu)化選擇,我們采用了醇提水溶法來制備蜂膠佐劑。蜂膠原膠在-20℃冰柜中冷凍過夜使變脆,取出后研磨粉碎,放入深色瓶中,按1：4的比例加入80%的乙醇,充分攪拌,置70℃索氏回流2h,然后于旋轉蒸發(fā)器中50℃濃縮成浸膏狀。通過試驗,選擇合適的助溶劑,將蜂膠浸膏溶于ph7.4的磷酸鹽緩沖液(pbs),然后配制成40mg/ml的溶液4℃避光保存?zhèn)溆谩?br>　　1.2.4配苗將上述pm90菌液與bb82菌液等量混勻后作為水相,蜂膠乙醇提取液作為佐劑相,水相與佐劑相等量混勻后加入終濃度為0.01%的硫柳汞,置膠體磨中以8000r/min攪拌5min,然后12000r/min攪拌5min。無菌檢驗合格的,即可分裝至疫苗瓶中,加塞、封蠟置4℃保存?zhèn)溆�。實驗室共生產(chǎn)兔巴氏桿菌-波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗6批,批號分別為:010510、010521、010615、010628、010709和010720。
　　1.2.5成品檢驗6個批次的兔巴氏桿菌-波氏桿菌二聯(lián)蜂膠滅活疫苗均進行了物理性狀、無菌檢驗以及安全檢驗。其中安全檢驗分3組進行,每組均使用了不同日齡(30、90、180天)的健康大耳白兔各20只。接種后觀察3周,記錄家兔的臨床反應、體溫以及是否有組織病變。3個組的試驗設計如下:一次單劑量接種組的疫苗接種量為2ml/只;單劑量重復接種組為2次接種,中間間隔1周,劑量為2ml/只;一次大劑量接種組的疫苗免疫量為6ml/只,采用皮下多點注射的方式進行。
　　1.2.6兔巴氏桿菌—波氏桿菌二聯(lián)滅活苗的效力試驗兔巴氏桿菌部分取4批二聯(lián)苗(批號:010521、010615、010709、010720),分為3個免疫劑量:1、2、3ml,分別注射1月齡左右的健康家兔各20只,5只作正常對照。3周后每只接種pm90株致死量,觀察14天,記錄每組的死亡數(shù)。
　　兔波氏桿菌部分取4批二聯(lián)苗(批號:010615、010628、010709、010720),分為3個免疫劑量:1、2、3ml,分別注射1月齡左右的健康家兔各20只,5只作正常對照。3周后每只接種bb82株致病量,以家兔咳嗽、鼻腔排出水樣或膿樣的鼻液,取鼻腔拭子能分離到bb82株作為發(fā)病標準。觀察14天,記錄每組的發(fā)病數(shù)。
　　2結果
　　2.1疫苗的物理性狀檢驗
　　本品為棕黃色均勻混懸液,長期靜置后底部有少許沉淀,可混勻。
　　2.2疫苗的無菌檢驗
　　待檢菌液在sms、t.g、g.a、g.p培養(yǎng)基上進行無菌檢驗,均無細菌生長。
　　2.3疫苗的安全性檢驗
　　各批次的疫苗接種家兔后,家兔的體溫、食欲無明顯變化,注射部位也無紅腫及硬結。
　　2.4疫苗的效力試驗
　　2.4.1家兔對巴氏桿菌的免疫保護試驗結果對照組的家兔在3天內全部死亡,從兔體的心、肝、脾、腎中都分離到了巴氏桿菌。2ml以上試驗組的死亡保護率均在90%以上(見表1 ……（未完，全文共3669字，當前僅顯示1853字，請閱讀下面提示信息。收藏《兔巴氏桿菌-波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、效力試驗》）