畢業(yè)論文：高壓靜電法制備ALG-g-Lys微球

題目：高壓靜電法制備ALG-g-Lys微球
院（系） 化工學(xué)院
專 業(yè) 生物工程
屆 別 2012屆

摘要
以海藻酸鈉（NaALG）和L-賴氨酸鹽酸鹽（L-Lys•HCl）作為底物，用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC•HCl）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）作為NaALG羧基的活化劑，制備Lys接枝的海藻酸鈉改性材料ALG-g-Lys。該材料在NaALG的基礎(chǔ)上引入了新的官能團(tuán)-NH2，以及6個(gè)C原子組成的小支鏈，保持了NaALG的離子凝膠性能。
利用高壓靜電法制備微球的裝置制備Ga2+凝膠的ALG-g-Lys膠珠，并對(duì)各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以便得到粒徑較小，分布均勻，球形度較好的微球。通過實(shí)驗(yàn)最后得出最佳的滴制微球條件為： ALG-g-Lys的濃度為1.5%，高壓靜電場的電壓為8.0kv，注射泵推進(jìn)速度為30mm/h，針頭型號(hào)為24G平針頭，CaCl2的濃度為1.5%。

關(guān)鍵詞：海藻酸鈉；接枝改性；L-賴氨酸；高壓靜電法；微球



Abstract
Sodium alginate ( NaALG ) and L- lysine hydrochloride ( L-Lys • HCl ) as substrates , 1-ethyl-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC•HCl) and N-hydro*ysuccinimide (NHS) as carbo*yl activators for NaALG, L-Lys is grafted onto the chain of sodium alginate to prepare ALG-g-Lys . The material on the basis of NaALG introduced a new functional
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創(chuàng)新點(diǎn) 27
參考文獻(xiàn) 28
致謝 30
附錄（文獻(xiàn)翻譯）
第1章 緒論
1.1 海藻酸鈉
海藻酸鈉(ALG，(C6H7O8Na)n)又名海帶膠、褐藻膠、藻酸鹽，是由海帶中提取的天然多糖碳水化合物。海藻酸鈉主要由海藻酸的鈉鹽組成，由β-D-甘露糖醛酸(M單元)與α-L-古羅糖醛酸(G單元)依靠α-(1-4)糖苷鍵連接并由不同比例的GM、MM和GG片段組成的共聚物（圖1.1）[1-3]。

圖1.1 海藻酸鈉結(jié)構(gòu)式
海藻酸鈉是一種天然、生物能降解的生物高聚物，穩(wěn)定無毒，是一種陰離子型聚合物，親水性強(qiáng)，不溶于乙醇、乙醚及其它有機(jī)溶劑。海藻酸鈉分子鏈中含有羧基，與金屬離子Ca2+、Ba2+、Sr 2+有著較強(qiáng)的結(jié)合性，其中Ca2+選擇性吸附多聚葡萄糖醛酸殘基(G段)順序間的構(gòu)象被稱為“egg-bo*”模型，在科學(xué)研究和生產(chǎn)上都有著廣泛的應(yīng)用，如用于藥物傳輸[4-8]，但該結(jié)構(gòu)的較大孔徑導(dǎo)致藥物突釋現(xiàn)象嚴(yán)重，難以達(dá)到控釋的效果。為了得到基于海藻酸鈉的有較好控釋效果的藥物載體材料，目前研究者們對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行了大量的改性研究。
1.2 海藻酸鈉的改性研究
海藻酸鈉作為藥物載體材料的改性主要涉及共混改性和化學(xué)改性[9-12]。
1．共混改性
共混改性包括靜電作用的成膜改性、互穿結(jié)構(gòu)改性和物理共混改性�；旌细男允购Ｔ逅徕c與具有特定性質(zhì)的物質(zhì)混合，可得到部分性能較優(yōu)越的復(fù)合材料�；旌细男缘牟僮骱唵�，條件溫和。但混合改性往往通過氫鍵和靜電作用等將混合物形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或者增強(qiáng)致密性，使混合物的剛性和孔隙率可控。近年來對(duì)該方面的研究較多，材料的選擇已經(jīng)涉及有機(jī)材料和無機(jī)材料，但因各種材料本身性質(zhì)的限制，有優(yōu)越性能的且能與海藻酸復(fù)合的材料不多，對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行混合改性得到性能優(yōu)越的復(fù)合材料，難有較大的突破。
2．化學(xué)改性
表1.1 海藻酸鈉的改性方法
按有無化合鍵生成分類 共混改性 化學(xué)改性
按反應(yīng)物作用方式分類 靜電作用的成膜改性 接枝改性
互穿結(jié)構(gòu)改性 交聯(lián)改性
物理共混改性 氧化改性
海藻酸鈉主鏈上存在大量的羧基與羥基，通過化學(xué)反應(yīng)可在羧基和羥基上進(jìn)行多種化學(xué)反應(yīng)，將多種化學(xué)物質(zhì)直接或間接的接在海藻酸分子鏈上。
（1）接枝改性
通過化學(xué)改性的方法在海藻酸鈉的羧基上接上疏水的基團(tuán)，增大疏水性，改善載體材料性能；海藻酸鈉接枝上溫敏或者pH敏感的材料也可得到相應(yīng)的智能材料；也可以通過相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)與丙烯酸鹽聚乙二醇、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸鹽、殼聚糖接枝形成對(duì)藥物具有一定緩控釋能力的接枝共聚材料，海藻酸鈉還可以通過中間物作為橋梁，與另一個(gè)不易與之發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)接枝[13]。
表1.2 海藻酸鈉的化學(xué)修飾方法
修飾基團(tuán) 羥基 羧基
化學(xué)修飾方法 氧化作用 酯化
還原-胺氧化 Ugi反應(yīng)
硫化 酰胺化
共聚
（2）氧化改性
海藻酸是天然多糖，因其良好的生物相容性與凝膠特性在生物材料領(lǐng)域備受關(guān)注，但它存在降解緩慢、降解不可控和降解釋放出的高分子鏈在體內(nèi)難以清除等不足。利用氧化劑對(duì)海藻酸進(jìn)行部分氧化，海藻酸解環(huán)，兩個(gè)羥基被氧化成兩個(gè)醛基；所得部分氧化的海藻酸的氧化度與降解率可由氧化條件控制。
當(dāng)前海藻酸鈉化學(xué)改性研究主要集中在構(gòu)建藥物的緩釋載體。相對(duì)而言，具有特異性親和的靶向性、溫度敏感性和磁響應(yīng)性的海藻酸改性材料研究得較少。今后的研究應(yīng)該結(jié)合近年來分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和蛋白組學(xué)上取得的研究成果，通過化學(xué)改性的方法將具有親和特異性的分子或者有特殊功能的物質(zhì)結(jié)合在海藻酸上，制得靶向性高或智能響應(yīng)好的載體材料，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)送和控制釋放。通過尋找新物質(zhì)探索新方法，相信基于海藻酸鈉定能構(gòu)建出性能更優(yōu)越的藥物載體材料。
1.3 羧基激活劑
1. EDC•HCl
EDC•HCl即1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽，用于多肽縮合劑和交聯(lián)劑[14]。EDC•HCl是水溶性碳二亞胺，分子呈線性結(jié)構(gòu)（圖1.2），用于羧基與伯胺的縮合反應(yīng)，并已獲得廣泛的用途。如在多肽合成中形成酰胺健、將半抗原結(jié)合于載體蛋白形成免疫抗原、通過與核酸5位的磷酸基團(tuán)反應(yīng)形成氨基反應(yīng)活性的NHS-酯等。EDC 通過與氨基反應(yīng)形成可與氨基反應(yīng)的O-�；逯虚g體。如果該中間體不與氨基反應(yīng)，則會(huì)很快水解并重新釋放出羧基基團(tuán)。
2. NHS
NHS即N-羥基琥珀酰亞胺，又名N-羥基丁二酰亞胺，分子式為C4H5NO3，分子量100，是無色或類白色粉末，易吸潮[15]。其溶于醇、酯等多種有機(jī)溶劑，遇水分解成丁二酸和氨，熔點(diǎn)為95~98℃。
NHS是一類極為重要的精細(xì)化學(xué)品和化工原料，由于結(jié)構(gòu)中含有活潑的氮羥基，可與抗原、抗體、酶及其核酸的氨基、羧基、或糖基共價(jià)結(jié)合，結(jié)合后又不影響它們的活性，故可常用作合成肽、抗生素、氨基酸、蛋白質(zhì)等的前體及親和色譜、腫瘤的診斷顯像和治療[9]。

圖1.2 EDC•HCl結(jié)構(gòu)式 圖1.3 NHS結(jié)構(gòu)式
3. EDC•HCl和NHS結(jié)合使用
EDC先活化羧基形成EDC/羧基活潑中間酯，由于這個(gè)酯在水中很容易水解（一般20-30min就有開始水解），導(dǎo)致羧基重新回到未活化狀態(tài)，所以需要加入NHS，NHS會(huì)與EDC/羧基活潑中間酯反應(yīng)形成NHS/羧基活潑中間酯，這個(gè)中間酯比較穩(wěn)定，能較長時(shí)間存在。因此EDC介導(dǎo)的縮合反應(yīng)在NHS的存在下，效率大大提高，更有利于羧基的激活。
1.4 L-Lys接枝改性ALG
運(yùn)用酰胺化反應(yīng)修飾海藻酸鈉羧基的原理，EDC與NHS作為羧基的活化劑，將L-Lys接枝到海藻酸鈉的分子鏈上，形成賴氨酸接枝海藻酸鈉的改性產(chǎn)物(ALG-g-Lys)。用透析法除去未參加反應(yīng)的小分子物質(zhì)及生成的小分子物質(zhì)，以達(dá)到純化產(chǎn)物的目的。所得材料溶液經(jīng)冷凍干燥得到干燥的ALG-g-Lys材料。
1.5 高壓靜電法制備微球
高壓微膠囊成型裝置如圖1.2所示，輸出電壓0～20kv; 微量注射泵推進(jìn)速度1～99mm/h。高壓發(fā)生器的正極接注射器針頭，負(fù)極放量杯底部。量杯內(nèi)裝氯化鈣溶液，注射器內(nèi)裝海藻酸鈉溶液。輸液泵以一定的速度向下推壓海藻酸鈉溶液，在電場力的作用下，海藻酸鈉溶液克服黏滯力和表面張力，呈一定粒徑的液滴滴入氯化鈣溶液中，凝膠化成不溶于水的海藻酸鈣凝膠珠[16-17]。

圖1.4 高壓微膠囊成型裝置示意圖
1.量杯 2.針頭 3.注射器 4.微量注射泵 5.支架 6.正極 7.負(fù)極 8.高壓發(fā)生器
ALG-g-Lys分子鏈上剩余較多的_羧基，可以與Ca2+快速形成“蛋網(wǎng)格”結(jié)構(gòu)而凝膠化。利用該特性可將ALG-g-Lys溶液經(jīng)注射泵推進(jìn)，在高壓電場中噴射入CaCl2溶液中，快速形成微米級(jí)的膠珠[18-20]。
1.6 本論文的主要研究內(nèi)容
1．三個(gè)不同Lys接枝度的材料ALG-g-Lys合成及表征。需要進(jìn)行FTIR、CNHO元素分析、分子量測定等的表征。
2．高壓靜電法制備微球的參數(shù)優(yōu)化。以粒徑為指標(biāo)對(duì)ALG-g-Lys濃度、電壓、針頭大小、推進(jìn)速度和CaCl2濃度及溶劑的優(yōu)化考察。需要得到制備穩(wěn)定性好的微球的最佳參數(shù)組合。



















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